近日，倫敦大學(xué)學(xué)院Helen C. Hailes教授團(tuán)隊(duì)在《Green Chemistry》上發(fā)表了題為“The discovery of new metagenomic urethanases utilising a novel colorimetric assay for applications in the biodegradation of polyurethanes”的研究論文。

該研究基于家庭排水系統(tǒng)宏基因組資源，成功挖掘出三種此前未報(bào)道的酰胺酶，并開發(fā)了一種基于酪氨酸酶（RsTYR）氧化反應(yīng)的高通量顏色測(cè)定法，可快速篩選具聚氨酯降解能力的酶類。研究結(jié)果表明，這些新型酶能有效水解以亞甲基二苯胺（MDA）為骨架的聚氨酯模型底物，并在經(jīng)過(guò)球磨與纖維素酶預(yù)處理的商業(yè)織物體系中，實(shí)現(xiàn)了彈性纖維組分的顯著降解。該研究為聚氨酯及其衍生纖維材料的生物降解與回收提供了新的酶學(xué)工具，并提出了可擴(kuò)展至其他難降解高分子的高效篩選與驗(yàn)證策略。

研究背景

全球塑料污染問(wèn)題日益嚴(yán)峻，其中紡織品廢棄物年產(chǎn)生量高達(dá)9200萬(wàn)噸，大部分最終被填埋或進(jìn)入環(huán)境。彈性纖維（Spandex）是聚氨酯（PU）類材料的典型代表，其分子結(jié)構(gòu)由芳香族“硬段”（多以4,4'-亞甲基二苯胺MDA為核心）和柔性的聚醚或聚酯“軟段”，這種“軟硬段”嵌段結(jié)構(gòu)賦予材料優(yōu)異的彈性與韌性，導(dǎo)致其在自然條件下極難降解。與PET等聚酯類塑料相比，聚氨酯的生物降解研究仍處于起步階段，尤其是能斷裂氨基甲酸酯鍵（–NH–COO–）的酰胺酶（urethanase）極為稀少。為此，研究團(tuán)隊(duì)以家庭排水系統(tǒng)這一富含蛋白質(zhì)殘?jiān)投鄻游⑸锶旱沫h(huán)境為樣本來(lái)源，構(gòu)建宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，并設(shè)計(jì)一種酪氨酸酶輔助的顯色測(cè)定體系，以實(shí)現(xiàn)對(duì)潛在聚氨酯水解酶的快速、高通量篩選與驗(yàn)證。

圖文導(dǎo)讀

圖1 從屬于AS 家族的排水宏基因組中新鑒定的酰胺酶（左）。檢索到的酰胺酶（包括文獻(xiàn)中報(bào)道的氨基甲酸酯酶）的單位矩陣百分比和相應(yīng)的分支圖。

研究團(tuán)隊(duì)利用自建的排水系統(tǒng)宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（富含蛋白質(zhì)殘?jiān)c微生物群），通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)搜索含amidase signature（AS）結(jié)構(gòu)域（PF01425）的開放閱讀框（ORF）。共識(shí)別出46條潛在序列，篩選得到9個(gè)完整序列并驗(yàn)證其具備典型的Ser–Ser–Lys催化三聯(lián)體（pQR3137–pQR3145）。這些基因被克隆至pET-29a(+)載體中表達(dá)，隨后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果顯示，這些新型酶與已報(bào)道的UMG-SP系列氨基甲酸酯酶在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成獨(dú)立分支，提示其可能具備新穎的底物識(shí)別位點(diǎn)與催化特征。

圖2 (A)彈性纖維模型基質(zhì)1a-1f  (B)開發(fā) MDA 氧化的 RsTYR 測(cè)定法。酶的濃度表示為總重懸浮凍干 CCL 粉末。

研究團(tuán)隊(duì)建立了一種基于MDA釋放與顯色反應(yīng)的快速檢測(cè)體系：酰胺酶水解MDA基模型底物（1a–1f）后釋放出MDA，隨后由RsTYR氧化生成紅色醌類化合物，從而實(shí)現(xiàn)酶活的直接顯色檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，在含 5 mg/mL 細(xì)胞裂解液的體系中，RsTYR 能在 18 小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)明顯顯色，形成高靈敏度的檢測(cè)反應(yīng)。相比傳統(tǒng)HPLC定量，該方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性高，且可在96孔板中并行操作，適合高通量篩選新型聚氨酯水解酶。

圖 3 使用顏色測(cè)定法初篩宏基因組酰胺酶對(duì)模型底物（1a-1d）的水解活性，pQR3139, pQR3141, pQR3144顯示陽(yáng)性（紅色）。

9種候選酶均在E. coli BL21中表達(dá)為粗酶液，利用顯色篩選其對(duì)模型底物1a–1d的水解活性。結(jié)果顯示，pQR3139、pQR3141和pQR3144 三種樣品在反應(yīng)后均出現(xiàn)顯著紅色變化，表明其具備酰胺酶活性。進(jìn)一步HPLC定量分析表明，這三種酶可有效水解PEG鏈長(zhǎng)度遞增的模型底物，且活性隨PEG鏈長(zhǎng)增加而增強(qiáng), 說(shuō)明其在疏水性底物識(shí)別上具顯著優(yōu)勢(shì)。

表 1 通過(guò)HPLC定量三種候選酶對(duì)模型底物(1a-1d)的轉(zhuǎn)化情況及MDA產(chǎn)率

底物1c和1d的水解轉(zhuǎn)化率為55–69%，生成MDA；1a和1b的轉(zhuǎn)化率較低（30–38%），產(chǎn)物以單水解中間體為主。結(jié)果與比色檢測(cè)一致，驗(yàn)證了顯色體系的準(zhǔn)確性與可靠性。研究指出，底物鏈長(zhǎng)與柔性程度顯著影響酶的底物適配性。

圖4 與pQR3139、3141和3144進(jìn)行1cd的時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)。使用酶作為CCL，總蛋白濃度為20 mg mL?1，酶含量為10%，反應(yīng)進(jìn)行24、48和72小時(shí)和1周，重復(fù)進(jìn)行。

以1c和1d為底物，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至7天，三種酶均表現(xiàn)出持續(xù)的水解能力，生成MDA及中間體（2a–2d）。其中，pQR3144在反應(yīng)一周后MDA產(chǎn)率最高（65%），表明其穩(wěn)定性和催化效率優(yōu)于其他兩種酶。

圖 5 商業(yè)織物（粘膠/彈性纖維、棉/彈性纖維）酶法降解工作流程，包括洗滌、球磨、纖維素酶預(yù)處理、酰胺酶處理及顏色測(cè)定。

為驗(yàn)證其應(yīng)用潛力，研究選擇含彈性纖維的商業(yè)織物。通過(guò)球磨（添加甲醇以增強(qiáng)纖維破碎）及纖維素酶預(yù)處理，破壞織物結(jié)構(gòu)、去除纖維素基質(zhì)，為酰胺酶降解聚氨酯段創(chuàng)造條件。

圖 6 經(jīng)pQR3139處理后的織物提取液在TYR測(cè)定中呈現(xiàn)陽(yáng)性顯色反應(yīng)（紅色），表明彈性纖維發(fā)生降解。

使用活性最高的pQR3139處理后，織物提取液經(jīng)RsTYR顯色檢測(cè)呈明顯紅橙色，而陰性對(duì)照無(wú)變化，表明聚氨酯組分被有效降解并釋放出MDA。1H NMR分析進(jìn)一步檢測(cè)到芳香環(huán)與甲撐橋信號(hào)峰，為降解反應(yīng)提供直接證據(jù)。

主要結(jié)論

本研究通過(guò)整合宏基因組挖掘、酶學(xué)篩選與應(yīng)用驗(yàn)證，系統(tǒng)地實(shí)現(xiàn)了聚氨酯降解酰胺酶的發(fā)現(xiàn)與功能鑒定。研究團(tuán)隊(duì)從家庭排水系統(tǒng)宏基因組中成功挖掘出三種新型酰胺酶（pQR3139、pQR3141、pQR3144），并證實(shí)其對(duì)MDA型聚氨酯模型底物具有顯著水解活性；同時(shí)，開發(fā)出基于酪氨酸酶氧化顯色反應(yīng)的高通量顏色測(cè)定法，實(shí)現(xiàn)了酰胺酶活性的快速篩選與定性檢測(cè)。進(jìn)一步地，研究在經(jīng)球磨與纖維素酶預(yù)處理的商業(yè)織物體系中驗(yàn)證了這些酶的降解能力，成功實(shí)現(xiàn)了聚氨酯彈性纖維的生物降解。該成果不僅拓展了聚氨酯及其他難降解高分子材料的生物降解酶資源庫(kù)，也建立了“宏基因組挖掘—酶顯色篩選—實(shí)體降解驗(yàn)證”的一體化研究策略，為未來(lái)通過(guò)酶工程與代謝途徑優(yōu)化提升聚氨酯降解效率提供了新方向，并為混合紡織品的分子級(jí)循環(huán)利用奠定了重要基礎(chǔ)。